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    公开号:WO1991017982A1
    申请号:PCT/JP1991/000665
    申请日:1991-05-20
    公开日:1991-11-28
    发明作者:Kazuhiko Tanzawa；Takeshi Ogita；Shuji Takahashi；Takeshi Kinoshita；Hideyuki Haruyama；Takeshi Kagasaki；Takao Okazaki；Ryuzo Enokita
    申请人:Sankyo Company, Limited；
    IPC主号:C07D487-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 書
    [0002] 新規化 吻マトリス夕チン
    [0003] [技術分野]
    [0004] 本発明はコラゲナ一ゼ阻害活性を有する新規化合物マ卜リスタチンに関する。
    [0005] [背景技術]
    [0006] コラゲナーゼは結合組織などの主要構] ¾)¾分の 1つであるコラーゲンを分解す る酵素であり、 このうち、 IV型コラゲナーゼは基 )111の主要成分である IV コラ
    [0007] —ゲンを分解する。 そして、 癌力生育する際の血 生、 癌の浸潤及び転移にお いては IV型コラゲナーゼ活 カ^ h昇し、 基 JSfiiの破壊に主要な役割を果たしてい ることが知られている （William G. Stetler-Stevenson ； Cancer and Metastasis Reviews, vol.9, 289-303, (1990) ) 0 従って、 コラゲナーゼ阻 ¾ は これら疾患の予防 ·治療に有用である。
    [0008] 従来、 コラゲナーゼ阻 用を示す低^! ¾質としてはメルカブト基を含むぺ プチド性化^!^ (Robert D. Gray, Hossain H. Saneii and Arno F. Spatola ； Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 101, No. 4 ， 1251-1258, (1981) /Charles F. Vencill, David Rasnick, Katherine V. Crumley, Norikazu Nishino and James C. Powers ； Biochemistry Vol. 24， 3149-3157, (1985) )、 カルボキシル基を含むペプチド性化合物 (Jean-Marie Delaisse, . Yves Eeckhout, Christopher Sear, Alan Galloway, Keith
    [0009] McCullagh and Gilbert Vaes ； Biochemical and Biophysical Research
    [0010] Communications, Vol.133, 483-490, (1985) )、 ベンジルォキシカルボ二ループ口 リル一ロイシルーグリシルヒドロキサム酸 （William M. Moore and Curtis A. Spilburg ； Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 136, 390-395, (1986) ) , ヒドロキシルァミン誘導体 （特開平第 1-160997号） など力 告されている。 また IV¾コラゲナ一ゼに対して比較的特異性の強いものとして SC 44463 (Reuven Reich, Erik W. Thompson, Yukihide Iwamoto, George R.
    [0011] Martin, James R. Deason, George C. Fuller, and Ruth Miskin ； Cancer Research, Vol.48, 3307-3312, (1988) )力 s報告されている。 この SC44463 は、 癌 転移抑制活性を示すこと力 ¾ft物実験により確認されている。 しかしこれらはいず れも合成品であり、 また未だ実用に供されていない。
    [0012] 一方、 蛋白性のコラゲナ一ゼ阻害物質としては Tissue Inhibitor of
    [0013] Metalloproteinase (TIMP)及びその類緣物質が知られている。 TIMPは組み換え D
    [0014] N A技術により か^ r能になっている力、 未だ実用に供されていない
    [0015] (Docherty. A. J. P, Lyons A, ^mith B. J, Wright E. , Stephens P. E， Harris T. J. R, Murphy G, and Reynolds J. J ； Sequence of human tissue inhibitor of metalloproteinases and its identity to erythroid- potentiating activity. Nature, vol. 318, 66-69, (1985) ) 0
    [0016] またヒドロキシァミノ化された 2—ペンチルコハク酸を有している点でマ卜リ スタチンと類似している化^として、 放線菌の培養瀘液から単離されたァクチ ノニン （actinonin)がある。 本化^！は、 アミノぺプチダーゼ Mを低濃度で阻害 すること力 S報告されている （Umezawa, H.， Aoyagi, T.， Tanaka, Τ. , Suda, Τ.， Okuyama, A.， Naganawa, H.， Hamada, M. and. Takeuchi, T. ： J. Antibiot.， vol.38, 1629-30, (1985) ) が IV型コラゲナーゼを阻害するかどうかは検討され ていない。
    [0017] [発明の開示]
    [0018] 本発明者らは、 土壌より分離したァクチノマデュラ属に属する放線菌 SANK 61488株 φ培養物から、 IV¾コラゲナーゼ阻難用を有する新規化^)、 マトリ スタチン類力 ¾ されることを見出し、 本発明を ¾ ^した。
    [0019] (発明の構成）
    [0020] 本発明のマトリスタチン （Matlystatin)は下記の構造式および性状を有する。 1) 構造式
    [0021]
    [0022] (式中、 R1は水素原子又は水酸基、 R2は水素原子又はメチル基、
    [0023] R3は、
    [0024] 式
    [0025] 、 又は、 を有する基を示す。
    [0026] 但し、
    [0027] R1が水酸基、 R2がメチル基のときは、
    [0028] R3は、 式 （n) 、 （m) 、 (IV) 又は （V) であり、
    [0029] R1が水素原子、 R2がメチル基のときは、
    [0030] R3は、 式 （Π) であり、
    [0031] R1が水酸基、 R2が水素原子のときは、
    [0032] Raは式 （IV) である。 ）
    [0033] また、 本発明における化^!名を下記の表のごとく定義する < 化合物名 R1 R2 Ra マ卜リスタチン OH CH3 " (Π)
    [0034] マ卜リスタチン A2 H CH3 (Π)
    [0035] マ卜リス夕チン OH CH3 (m)
    [0036] マ卜リスタチン OH CH3 (IV)
    [0037] マトリスタチン OH H ( )
    [0038] マ卜リス夕チン Ft OH CH3 (V)
    [0039] (表中、 R R2および Raは、 式 (I) における R1 R2および R3を示! (Π) 、 (Π) 、 (IV) 及び （V) は上言己と同意慕を示す。 ） 2)物性
    [0040] マトリスタチン A,
    [0041] 1) 性 質；白色、 吸湿性粉末、 メタノール又はクロ口ホルム中では室温 で不安定。
    [0042] 2) 溶 解 性；メタノールに易溶、 水、 クロ口ホルムに難溶。
    [0043] 3) 呈色試験； 50%硫酸、 ヨウ素、 ニンヒドリン反応に陰性。 塩化第二鉄反 応に陽性。
    [0044] 4) 分 子 式； C27 «70aN5S
    [0045] 5) 分 子 量； FAB-MASS法により決定 （M+H) +
    [0046] 602.3198 (測定値）
    [0047] 602.3224 (計算値）
    [0048] 6) 融 点； 113-115 。C (分解）
    [0049] 7) 比旋 ； [a]D 25 一 38.9°
    [0050] (c, 1.06 メタノール）
    [0051] ) 紫外線吸収スペクトル； λπ>Μ nm
    [0052] メタノール中で に極大吸収を示す。
    [0053] ) 赤外線吸収スペクトル； v (KBr) cm"1
    [0054] KBrディスクで測定した赤外線吸収スぺクトルは以下の極大吸収を示す。
    [0055] 3292、 2961、 2932、 2873、 2861、 1719、 1655, 1627、 1537、 1443、 1414、 1379、 1241
    [0056] ) —核磁気共鳴スぺク卜ル； （ δ : PPM )
    [0057] 重メタノール中、 内部 ¾ ^に TMS (テトラメチルシラン） を使用して測定 した ^ —核磁気共鳴スペクトル （400 MHz ) は以下のとおりである。
    [0058] 0.88(t,3H), 0.89(t，3H)， 0.94 (d, 3H) , 1.0-1.8 (m, 12H) , 1.98 (m, 2Η) , 2.02 (s, 3Η), 2.1-2.5(m,3H), 2.7-3.0 (m, 6H) , 3.0-3.1 (m，2H)，
    [0059] 3.98(m, 1H), 4.40(d，lH)， 4.59 (t,lH), 5.17(d, 1H)
    [0060] ) 13C一核磁気共鳴スぺクトル； （ δ ： PPM )
    [0061] 重メタノール中、 溶媒のシグナルを (メタノールの中心にあるシグナ ルを 49.3 ppmとする） として測定した13 C —核磁気共鳴スペクトルは以下 のとおりである。
    [0062] 209.8 (s), 179.6 (s), 174.6 (s), 174.6 (s), 173.6 (s), 171.8 (s), 64.2(d), 52.1(d), 52.0(d), 47.9 (t), 42.0 (t) , 37.9(d), 36.9 (d) , 36.2 (t), 35.1(t), 33.7 (t), 32.9 (t), 27.6 (t) , 27.3 (t), 27.0(t), 25.7 (t), 23.4 (t), 22.6(q), 22.0(t), 16.4 (q), 14.4 (q), 11.7 (q)) 高速液体クロマトグラフィー
    [0063] 分離カラム；ノバパック ·カー卜リツジ
    [0064] 8 VC18 (カラムサイズ， φ8Χΐ00 ππ， ウォーターズ社製） 溶 媒； 58% (ν/ν)メタノ一ル /0.2 % (ν/ν)卜リェチルァミン一
    [0065] リン酸 （ ΡΗ 3.0 )
    [0066] 流 速； 1.5 ml /分
    [0067] 検 出； UV 210 nm
    [0068] 保持時間； 90分
    [0069] マトリスタチン A2
    [0070] ) 性 質；白色、 吸湿性粉末。
    [0071] ) 溶 解 性；メタノールに易溶、 水、 クロ口ホルムに難溶。
    [0072] ) 呈色試験； 50%硫酸、 ョゥ素、 ニンヒドリン反応に陰性。
    [0073] ) 分 _子 式； C27 «707N5S
    [0074] ) 分 子 量； FAB-MASS法により決定（M+H) +
    [0075] 586.3281 (測定値）
    [0076] 586.327 & (計算値）
    [0077] ) 融 点； 71-74 °C
    [0078] ) 比旋光度； [CZ] D2S — 37.Γ
    [0079] (c， 1.11 メタノール）
    [0080] ) 紫外線吸収スぺクトル； ； M nm
    [0081] メタノール中で に極大吸収を示す。
    [0082] ) 赤外線吸収スペクトル； max (KBr) cnT1 KBrディスクで測定した赤外線吸収スぺクトルは以下の極大吸収を示す。
    [0083] 3311, 2961、 2932, 2873、 2862、 1718, 1667、 1627、 1541、 1443、 1408、 1308、 12430) 核磁気共鳴スぺクトル； （ δ ： PPM )
    [0084] 重メタノール中、 内部 に IS を使用して測定した1 H—核磁気共鳴スぺ クトル （400 MHz ) は、 以下のとおりである。
    [0085] 0.88 (t,3H), 0.90(t,3H), 0.93 (d, 3H), 1.0-1.8 (m,12H) , 1.96(ιπ, 2Η) , 2.01 (s, 3Η), 2.13(m, 1Η) , 2.29 (dd, 1H) , 2.53 (dd, 1H) , 2.7-2.9 (m, 6H) , 2.9-3.1(m,2H), 3.92(m，lH)， 4.39 (d, 1H) , 4.57 (dd, 1H) , 5.18 (d, 1H)1) 13C 一核磁気共鳴スぺクトル； （ δ ： PPM )
    [0086] 重メタノール中、 溶媒のシグナルを ¾i (メ夕ノールの中心にあるシグナ ルを 49.3 ppmとする） として測定した13 C —核 共鳴スペクトル
    [0087] (100 MHz ) は、 以下に示す通りである。
    [0088] 209. l(s) ， 179.5 (s) , 177.3 (s) ， 174.3 (s) ， 174.3 (s) ， 173. l(s) ， 64.2(d) ， 54.0(d) ， 51.9(d) ， 47.9 (t) ， 42.0 (t) ， 38.7 (t) ， 38.0(d) ， 36.9(d) , 35.2 (t) , 33.7 (t) ， 33.0(t) ， 27.6 (t) ， 27.5 (t) ， 26.9 (t) ， 25.7 (t) ， 23.5 (t) ， 22.6 (q) ， 22.2 (t) ， 16.4 (q) , 14.4 (q) ， 11.7 (q)
    [0089] ) 高速液体クロマトグラフィー
    [0090] 分 カラム；ノバパック ·カートリッジ
    [0091] 8NVC18 (カラムサイズ， 08X100圆， ウォーターズ社製） 溶 媒； 58% (v/v)メタノール Z0.2 % (v/v)卜リェチルァミン一
    [0092] リン酸 (pH 3.0)
    [0093] 流 速； l.S rolZ分
    [0094] 検 出； UV 210 nm
    [0095] 保持時間； 7.82分
    [0096] マトリス夕チン
    [0097] ) 性 質；白色、 吸湿性粉末、 メタノール又はクロ口ホルム中では室温 で不安定。 ) 溶 解 性；メタノール、 クロ口ホルムに易溶、 水に難溶。
    [0098] ) 呈色試験； 50%硫酸、 ョゥ素、 ニンヒドリン SiEに陰性。 塩化第二鉄反 応に陽性。
    [0099] ) 分 子 式； C22H4。Ni05
    [0100] ) 分 子 量； FAB - MASS法により決定（M+H) +
    [0101] 441.3082 (測定値）
    [0102] 441.3078 (計算値）
    [0103] ) 融 点； 57-61 °C (分解）
    [0104] ) 紫外線吸収スぺク卜ル； J ai nm
    [0105] メタノ一ル中で ^に極大吸収を示す。
    [0106] ) 核 鳥スぺクトル； （δ： PP )
    [0107] 重クロ口ホルム中、 内部^に 1¾Sを使用して測定した1 H—核磁気其鳴ス ぺクトル （400 MHz)は、 以下に示す通りである。
    [0108] 0.83(t, 3H), 0.86(t,3H), 0.92(d, 3H) , 1.09 (t, 3Η), 1.09(m，lH)，
    [0109] 1.2-1.9 (m,12H), 1.98 (m, 1H) , 2.03 (m, 1H) , 2.31(dd，lH)， 2.49 (dd, 1H) , 2.55(q,lH), 2.82 (m, 1H) , 3.01 (m, 1H) , 3.93(ra,lH)， 4.63 (dd, 1H) , 4.71(dd，lH), 5.28(d, 1H) , 7.25(d，lH)
    [0110] ) 13C-核磁気共鳴スぺクトル （ δ : PPM )
    [0111] 重 ロ口ホルム中、 溶媒のシグナルを基準 （クロ口ホルムの中心のシグナ ルを 77.7 ppmとする） として測定した13 C—核磁気共鳴スペクトル
    [0112] (100 MHz ) は、 以下に示す通りである。
    [0113] 211.3 (s) , 177.3 (s) , 172.3 (s) ， 169.8 (s) ， 62.2(d) ， 50.2(d) ， 47.4 (t) ， 36.9(d) ， 36.8(d) , 34.8 (t) ， 34.6 (t) ， 32.7 (t) ， 31.8 (t) ， 26.3 (t) ， 26.3 (t) ， 24.3 (t) ， 22.4 (t) ， 20.9 (t) ， 16.1(q) , 14.0(q) ， 11.5 (q) ， 7.6(q)
    [0114] ) 高速液体クロマトグラフィー
    [0115] 分離カラム：ノバパック ·カートリツジ
    [0116] 8 VC18 (カラムサイズ、 φ8Χΐ00 ηπ、 ウォーターズ社製） 溶 媒： 70%メタノール/ 0.2 %トリェチルァミン一リン酸 (pH 3.0) 流 速： 1.5 ml/分
    [0117] 検 出： UV 210 nm
    [0118] 保持時間： 7.53分
    [0119] マトリスタチン
    [0120] 1) 性 質 ；白色、 吸湿性粉末。
    [0121] 2) 溶 解 性；メタノールに可溶、 水、 クロ口ホルムに難溶。
    [0122] ) 分 子 式； C27H45N606
    [0123] ) 分 子 量； FAB-MASS法により決定（M+H) +
    [0124] 549.3385 (測定値）
    [0125] 549.3400 (計算値）
    [0126] ) 融 点； 122— 126。C (分解）
    [0127] ) 比旋光度； [ct]D 2S — 20. 26°
    [0128] (c 1. 14 メタノール）
    [0129] ) 紫外吸収スペクトル；メタノール中で 228-230nm(sh ε 7690)に極大吸 収を示す。
    [0130] ) 赤外吸収スペクトル； max (KBr) cm" 1
    [0131] KBrディスクで測定した赤外線吸収スぺクトルは以下の極大吸収を示す。
    [0132] 3261, 2960, 2931, 2873， 2860, 1637, 1545， 1515, 1444, 1408， 1376, 1351， 1296, 1238
    [0133] ) 核磁気共鳴スペクトル
    [0134] 重 DMS0 (ジメチルスルホキシド） 中、 内部基準に TTUS を使用して測定した 核磁気共鳴スペクトル （500 MHz)は、 以下に示す通りである。
    [0135] 0.76 (d, 3H) , 0.82 (t， 3H)， 0.84 (t,3H)， 1.17 (m， 1H)， 1.18 (m, 2H) , 1.26 (m,2H )， 1.30 (m，lH)， 1.34 (m，2H)， 1.34 (m, 1H) , 1.44 (m,lH)， 1.48 (m, 1H) , 1.49 (m, 1H)， 1.68 (m, 1H) , 1.90 (m, 1H) , 1.94 (m, 1H) , 1.97 (m，lH)， 1.99 (m， 1H)， 2.02 (m, 1H) , 2.03 (m, 1H)， 2.25 (dd，lH)， 2.56 (m, 1H) , 2.63 (dd， 1H)， 2.87 (dd，lH)， 3.63 (m, 1H) , 4.23 (m, 1H) , 0
    [0136] 4.49 (ra，lH)， 4.81 (t, IH) , 4.84 (t，lH)， 4.97 (brd, IH)，
    [0137] 5.09 (brd, IH) , 6.83 (d, IH) , 8.31 (d.lH), 8.54 (d,lH)， 10.31 (s，l) 13C-核磁気共鳴スぺク卜ル
    [0138] 重 DMS0中、 溶媒のシグナルを基準 （0 0の中; のシグナルを39.5 ppmとす る） として測定した13 C —核 共鳴スペクトル （125 MHz ) は、 以下に 示す通りである。
    [0139] 175.6 (s)， 170.9 (s)， 167.9 (s) , 166.4 (s)， 149.5 (s)， 135.3 (d) , 106.8 (d), 62.1 (d), 50.1 (d) , 49.4 (d) , 48.3 (t)， 46.5 (t)， 36.7 (d)， 36.7 (d)， 34.6 (t) , 31.6 (t), 31.3 (t)， 25.7 (t) ,
    [0140] 25.7 (t)， 24.5 (t), 23.3 (t)， 21.8 (t)， 20.6 (t), 17.1 (t)，
    [0141] 15.5 (q), 13.8 (q), 10.4 (q)
    [0142] ) 高速液体クロマトグラフィー
    [0143] 分離カラム：ノバパック ·力一卜リツジ
    [0144] 8 VC18 (力ラムサイズ、 φ 8 X 100 ππ、 ゥォ一夕ーズ社製） 溶 媒： 55% (ν/ν) メタノール/ 0.2 % (ν/ν) トリェチルァミン-リン 酸 ( Η 3.3)
    [0145] 流 速： 1 mlZ分
    [0146] 検 出： UV 210 run
    [0147] 保持時間 ： 4.90分
    [0148] マ卜リスタチン
    [0149] ) 性 質；白色、 吸湿性粉末。
    [0150] ) 溶 解 性；メタノールに可溶、 水、 クロ口ホルムに難溶。
    [0151] ) 分 子 式； G2sH43Ns06
    [0152] ) 分 子 量； FAB-MASS法により決定（M + H) +
    [0153] 535.3229 (測定値）
    [0154] 535 · 3243 (計算値）
    [0155] ) 融 点； 89-94 °C
    [0156] ) im^t ; [ ]v2S -21.95 ° (c， 0.41 メタノール）
    [0157] 7) 紫外吸収スペクトル；メタノール中で 228-230nm(sh ε 8770)に極大吸 収を示す。
    [0158] 8) 赤外吸収スペクトル； max (KBr) cm" 1
    [0159] KBrディスクで測定した赤外線吸収スぺクトルは以下の極大吸収を示す。
    [0160] 3257， 2960, 2933, 2873, 1638, 1544, 1515, 1442, 1409, 1377， 1350, 1269, 1239
    [0161] 9) 核磁気共鳴スぺク卜ル
    [0162] 重 DMSO中、 内部 に TMS を使用して測定した1 H—核 共鳴スペクトル
    [0163] (500 MHz)は、 以下に示す通りである。
    [0164] 0.76 (d，3H), 0.82 (t,3H)， 0.84 (t,3H)， 1.17 (m,lH)， 1.18 (m,2H)， 1.26 (m，2H)， 1.30 (m,lH)， 1.34 (m,2H)， 1.34 (m,lH)， 1.44 (m, 1H) ,
    [0165] 1.48 (m, 1H) , 1.49 (m, 1H) , 1.68 (m, 1H) , 1.90 (m，lH)， 1.94 (m， 1H)， 1.97 (m，lH)， 1.99 (ra，lH)， 2.02 (m，lH)， 2.03 (m，lH)， 2.25 (dd'lH), 2.56 (m, 1H) , 2.63 (dd, 1H) , 2,87 (dd，lH)， 3.63 (m, 1H) , 4.23 (m，lH)，
    [0166] 4.49 (m, 1H) , 4.81 (t， 1H)， 4.84 (t，lH)， 4.97 (brd, 1H) ,
    [0167] 5.09 (brd, 1H) , 6.83 (d， 1H)， 8.31 (d,lH)， 8.54 (d, 1H) , 10.31 (s，lH)) 13C-核磁気共鳴スペクトル
    [0168] 重 D_MS0中、 溶媒のシグナルを基準 （DMSOの中心のシグナルを 39.5 ppmとす る） として測定した13 C —核磁気共鳴スペクトル （125 MHz ) は、 以下に 示す通りである。
    [0169] 175.7 (s)， 170.9 (s)， 168.0 (s)， 166.9 (s)， 149.4 (s)， 135.2 (d)，
    [0170] 106.8 (d), 62.2 (d)， 50.1 (d)， 49.5 (d) , 48.2 (t)， 46.4 (t)，
    [0171] 36.6 (d)， 36.6 (d)， 34.6 (t)， 31.3 (t)， 28.3 (t)， 25.7 (t)，
    [0172] 24.4 (t), 23.3 (t), 22.1 (t)， 20.6 (t)， 17.1 (t)， 15.4 (q)，
    [0173] 13.7 (q), 10.3 (q)
    [0174] ) 高速液体クロマトグラフィー
    [0175] 分離カラム：ノバパック 'カー卜リツジ 8 VC18 (カラムサイズ、 Φ8Χ100画、 ウォーターズ社製） 溶 媒： 50% (v/v) メ夕ノ一ル Z0.2 % (ν/ν) 卜リェチルァミン一 リン酸 （ΡΗ3.3 )
    [0176] 流 速-. 2 mlZ分
    [0177] 検 出： UV 210 ran
    [0178] 保持時間 ： 3.90分
    [0179] マトリス夕チン Ft
    [0180] ) 性 質；白色、 吸湿性粉末。
    [0181] ) 溶 解 性；メタノールに可溶、 水、 クロ口ホルムに難溶。
    [0182] ) 分 子 式； C27H45N606
    [0183] ) 分 子 量； FAB-MASS法により決定（M+H ) +
    [0184] 549.3388 (測定値）
    [0185] 549.3400 (計算値）
    [0186] ) 融 点； 69-75 V
    [0187] ) 比旋光度； [σ]。25 +1.43°
    [0188] (c， 0.14 メタノール）
    [0189] ) 紫外吸収スペクトル；メタノール中で 228-230nm(sh、 ε 7030)に極大吸 収を示す。
    [0190] ) 赤外吸収スペクトル； m x (KBr) cm" 1
    [0191] KBrディスクで測定した赤外線吸収スぺクトルは以下の極大吸収を示す。 3205 (br)， 2960,2933, 2873,2861, 1638, 1543， 1517, 1461, 1443, 1379, 1318,1294,1240
    [0192] ) 一核磁気共鳴スぺクトル
    [0193] 重 DMS0中、 内部 に IMS を使用して測定した1 H—核磁気共鳴スペクトル
    [0194] (500 MHz)は、 以下に示す通りである。
    [0195] 0.78 (d, 3H), 0.86(t,3H), 0.86(t,3H), 1.12 (m, 2H) , 1.15(m, 1H) , 1.16(m, 2H), 1.20(m, 2H) , 1.34 (m, 1H) , 1.37 (m, 1H) , 1.37(m, 1H) , 1.38(m，lH)， 1.58(m，lH)， 1.71(m，lH)， 1.88(m，lH)， 1.90 (in, 1H), 3
    [0196] 1.96(m, IH), 1.97(m，lH), 1.97 (m, IH) , 2.16(m, IH) , 2.23 (dd, IH) , 2.46 (m,lH), 2.65(t,lH) , 2.87(m,lH), 3.69(m, IH), 4.12 (m, IH) t. 4.61 (m, IH) , 4.74 (brd, IH), 4.80 (brd, IH) , 4.96 (brd, IH)，
    [0197] 5.00 (brd, IH), 6.75 (d, IH) , 8.30(d, IH) , 8.80(d，lH)， 10.28(s,lH) ) 13C-核磁気共鳴スペクトル
    [0198] 重 DMSO中、 溶媒のシグナルを基準 （DMSOの中心のシグナルを 39. 5ppm とする） として測定した13 C —核磁気期 スペクトル （125 MHz ) は、 以 下に示す通りである。
    [0199] 175.9 (s)， 171.9 (s)， 167.9 (s)， 167.5 (s)， 149.8 (s)， 138.4 (d)， 104.5 (d)， 64.0 (d), 49.7 (d)， 48.6 (d), 46.9 (t)， 46.3 (t) , 37.2 (d)， 35.6 (d)， 34.6 (t)， 31.7 (t)， 31.3 (t) , 25.9 (t)，
    [0200] 25.7 (t)， 24.5 (t)， 23.0 (t) , 21.8 (t)， 20.7 (t) , 17.4 (t) ,
    [0201] 14.8 (q), 13.8 (q), 10.5 (q)
    [0202] ) 高速液体クロマトグラフィー
    [0203] 分離カラム：ノバパック ·カートリツジ
    [0204] 8 VC18 (カラムサイズ、 φ 8 Χΐ00 ππη、 ウォーターズ社製） 溶 媒： 55%メタノール/ 0.2 %(ν/ν) トリェチルアミソ-リン酸 -
    [0205] (ρΗ 3.3)
    [0206] 流 _ 速： 2 mlZ分
    [0207] 検 出： UV 210 nm
    [0208] 保持時間 ： 4.30分 本発明は、 また、 ァクチノマデュラ属に属するマトリス夕チン^菌、 SANK 6 1488株に関するものである。 その菌学的性状は次の通りである。
    [0209] 1. 形態学的性状
    [0210] ISP [ジ.インターナショナル ·ストレブトミセス 'プロジェクト （Ihe International Streptomyces Project ) 規定の培 ¾±、 28°C、 14日間培養後、 顕微 鏡下観察では SANK 61488株の気菌糸は単純分枝である。胞子鎖は気菌糸上にのみ 着生し、 菌糸に対してほぼ直角に主として 2— 4個の短い連鎖を形成する。 胞子 の表面構造は平滑状 (smooth) である。 分枝、 菌核、 寄生菌糸の断裂、 胞子 のうなどの特殊器官は観察されない。
    [0211] 2. 各種培鐘上の諸性質
    [0212] 各種培養基上で 28°C、 14日間培養後の性状は第 1表に示す通りである。 色調の 表示は日本色彩研術版、 "標準色表 のカラーチップ ·ナンバーを表す。
    [0213] 培地の種類 項目 SAN 61488株の性状 シュクロー G 良好、 平坦、 灰味白
    [0214] ス ·硫酸塩 (N-9)
    [0215] 寒天 AM あまり良くない、 粉状、 白
    [0216] R 黄味灰 (1-9-10)
    [0217] SP 庠牛せず グルコース · G -.平坦—^ 灰味 ァスパラギン ォリーブ （3— 6 - 10) 寒天 AM 僅かに形成、 粉状、 白
    [0218] R 灰味ォリーブ（3— 5— 10)
    [0219] SP 庠牛せず 5
    [0220] グリセリン - G 非常に 、 平坦一^^状、 ァスパラギン オリ—ブ灰 (2- 5- 1 0) ρ¾ 1
    [0221] p D#J7P (2—4— 9)
    [0222] S p 陪ぃ昔 ffife本 ( 3— 4— 8 ")
    [0223] 澱粉 -無機塩 G 平坦— 状、 寒天 （ISP4) 灰味白 （N - 9)
    [0224] AM あまり良く !'、、 粉状、 白 蓮 v^苗i1^ ffifef^ -sz. ί、 " 2— q— q )ノ g¾¾ャ：廿ず 4
    [0225] チロシン寒天 G 非常に跳 平坦—離状、
    [0226] (ISP7) オリ一ブ （ 4一 4一 1 1 )
    [0227] AM あまり良くない、 ¾S^ ^r ή
    [0228] Ώ
    [0229] B¾し、本 ( A — Λ — ς
    [0230] ペプトン · G 良好、 隆起状、 薄オリ一ブ ィーストェキ (4- 6- 1 0)
    [0231] ス ·鉄寒天 AM 形成せず
    [0232] (ISP6) R 灰味気茶 (3- 5-8)
    [0233] SP 薄黄味茶 (3-7-8) 6
    [0234] 栄鶴天 G 平坦、 黄味灰 (1-9-
    [0235] (Difico) 10)
    [0236] AM 僅かに形成、 粉状、 白
    [0237] R 黄味灰 (2-9-10)
    [0238] SP 庠牛せず
    [0239] イーストェキ G 非常に跳 平坦一^^、 ス .麦芽ェキ 黄味茶 (4-6-9) ス、 ·実ゝ天ノ、 AM 僅かに形成、 粉状、 白
    [0240] (ISP2) R 暗い黄味茶 (3-3-8) s P 黄味茶（ 6— 5— 7
    [0241] オートミール G 常に^ 、 平坦、 灰味白 実天 (ISP3) ( N - 9 )
    [0242] AM 舰- 粉状- 白
    [0243] R 薄黄味橙 (2-9-9)
    [0244] S P 庠牛せず
    [0245] 水寒天 G あまり良くない、 平坦、 灰味白
    [0246] (N-9)
    [0247] AM 僅かに形成、 粉状、 白
    [0248] R 黄味灰 (1-9-10)
    [0249] SP 庠牛せず 7
    [0250] ポテトエキス G 良好、 平坦、 灰昧白 （N— 9)
    [0251] •人参エキス AM 僅かに形成、 粉状、 白
    [0252] '寒天 R . 黄味灰 (1-9-10)
    [0253] SP 庠牛せず
    [0254] G：生育 AM ：気菌糸 R：裏面 S P：可溶性色素. 生理学的性質
    [0255] SANK 61488株の生理学的性質は第 2表に示す通りである c
    [0256] 第 2 表
    [0257] 澱粉の水解 陰性
    [0258] ゼラチンの液化 陰性
    [0259] 硝酸塩の還元 離
    [0260] ミルクの凝固 陰性
    [0261] ミルクのペプトン化
    [0262] 生育温度範囲 （培地 1 ) * 18-41 °C 生育適正温度 （培地 1) 25-34 °C 食塩耐性 （培地 1) >2%-<3 ゼインの分解 瞧
    [0263] チロシンの分解 陰性
    [0264] キサンチンの分解 陰性
    [0265] メラニン様色素 性 （培地 2) 離
    [0266] (培地 3) 隱
    [0267] (培地 4) 隱
    [0268] * ：培地 1 ；ィ一ス卜エキス ·麦芽エキス寒天 (ISP2)
    [0269] 2 ; トリプトン ·イーストエキス ·ブロス （ISP2)
    [0270] 3 ；ペプトン ·イーストエキス ·鉄寒天（ISP6)
    [0271] 4；チロシン寒天 (ISP7) また、 プリドハム ·ゴトリ一ブ寒天培地を使用して、 28° 14日間培養後の炭 素源の資化性を調べた。 結果を第 3表に示す。
    [0272] 第 3 表
    [0273]
    [0274] + :利用する 一：利用しない
    [0275] 4. 菌体成分について
    [0276] SANK61488株の細胞壁は長谷川らの方法 [長谷川等、 ザ ·ジャーナル ·ォブ · ジェネラル ·アプライド ·マイクロバイオロジー （ The Journal of General Applied Microbiology )、 29巻 319-322頁、 1983年） ] に従い検討した結果、 メ ソジアミノピメリン酸が検出された。 また、 SA K 488株の全細胞中の糖成分を ェム ·ピ一 レシエバリエの方法 [M. P. Lechevalier , ジャーナル ·ォブ ·ラボ ラトリ一 ·アンド ·クリニカル ·メディシン （Journal of Laboratory and Clinical Medicine) . 71巻 34 - 944頁、 1968年） に従い検討した結果、 グルコ一 ス、 ガラクトース、 マンノース、 リボ一スの他、 微量のマジュロース力 s検出され た。
    [0277] さらに SA K61488株のメナキノンを [放線菌の同定実験法：日本放線菌学会 編、 （1985年） ]記載の方法で調べたところ主要なメナキノンは MK-9 (HS)であつ た。 I^Lhのことから本菌株は放線菌の中でもァクチノマデュラ属に属することは 明らかである。 ァクチノマデュラ属の中で SA K61488株に最も皿と考えられる 既知菌種としてァクチノマデュラ ·アトラメンタリア （Actinomadura atramenta ria) [インターナショナル，ジャーナル ·ォブ ·システマティック ·バクテリオ ロジ一 ( International Journal οτ systematic Bacteriology)、 37 、 342 ― 346頁、 1987年] 力と考えられる。 そこで SA K61488株とァクチノマデュラ ·アト ラメンタリア JCM 6250株との比 行培養を実施したが、 種を E ^する程の差異 は認められなかった。 そこで SA K61488株はァクチノマデュラ ·アトラメンタリ ァに属する新菌株であると同定し、 ァクチノマデュラ 'アトラメンタリア (Acti nomadura atramentaria) SA K&1488株と命名し、 1 9 9 0年 1月 1 0日に曰本国 微生物工業技術研爾に国内寄託をし （»：研菌寄第 11185号： FP-11185) 、 さ らに、 1 9 9 1年 3月 2 0日に、 日本国徬性物ェ m¾術研 に国際寄託をした (微ェ研条寄第 3327号： BP-3327 ) 。
    [0278] 周知の通り、 放線菌は自然界において、 また人工的な操作 （例えば、 紫外線照 射、 放射線照射、 化学薬品処理等） により、 変異をおこしゃすく、 本発明の SANK 61488株もこの点は同じである。 本発明にいう SA K61488株はそのすベての変異 株を包含する。 また、 これらの変異株の中には、 遺伝学的方法、 例えば組換え、 形質導入、 形質転換等により得られたものも包含される。 すなわち、 本発明では マトリスタチンを生産し、 SA K&1488株およびその変異株と明確に区別されない 菌株は、 すべて SA K61488株に包含されるものである。
    [0279] 本発明の SA K61488株はオース卜ラリァ国ダービー市周辺より した土壌を あらかじめ 意した滅菌水で ^した。 ついで、 下記に示した糸誠の分離用 寒天培地 H A培地に Μ¾し、 28°Cにて 10日間培養することにより出現してくる放 線菌のコロニーの中から分離することができた。
    [0280] H A培地
    [0281] 燐酸 素ナトリウム 0.2 g
    [0282] 塩化カリウム 0.1 g
    [0283] 硫酸第一鉄 0.1 g
    [0284] 硫酸マグネシウム 0.1 g
    [0285] 炭酸カルシウム 5.0 g
    [0286] フミン酸 2.0 g
    [0287] 寒天 20.0 g 蒸留水 1000 ml
    [0288] H (滅菌前） 7.4
    [0289] 本発明の新菌株を分離するに際し使用される分離培地としては炭素源、 窒素源 、 無機イオンおよび有機栄養源等より選択されたものを適宜含有する培地であれ ば合成または天然培地の何れでも使用可能である。
    [0290] 本発明は、 ァクチノマデュラ属に属するマトリスタチン^菌を培養し、 その 培養物よりマ卜リスタチンを,することを とするマ卜リスタチンの 法 に関するものであり、 さらに詳しくは、 菌が SANK 61488株である^^法 に関するものである。
    [0291] マ卜リス夕チンは SANK 61488株を適当な培地で培養し、 それから すること によって得られる。 栄養源としては、 菌類の菌株の培養に利用されてい る公知のもの力 用できる。 例えば、 炭素源としてはグルコース、 シュクロース 、 澱粉、 グリセリン、 水飴、 糖蜜、 ^油などカ 用できる。 また、 窒素源とし ては大豆粉、 コーンスチ一プリカ一、 硫酸アンモニゥム、 硝酸ナトリウム等を使 用しうる。 このほカ^^に応じて炭酸カルシウム、 リン酸塩等の^ を添加 するほか、 菌株の発育を助け、 マトリスタチンの生産を促進するような有機およ び無機物を適当に添加することができる。 培養法としては、 一般の 5¾物質を生. 産する方法と同じく液 咅養法、 特に深 養法が最も適している。培養は、 好 気的条件下で行なわれ、 培養に適当な温度は 24-30でであるが、 多くの場合 28°C 付近で培養する。 マトリス夕チンの^は、 MM培養で通常 5-10日で最高値に達 する。
    [0292] 培養終了後、 培養液中の液体部分に存在する菌体、 その他の固形部分を、 珪藻 土をろ過操作助剤とするろ過操作または遠心分離によつて分別し、 そのろ液また は上清中に存在するマ卜リスタチン類を、 IV型コラゲナ一ゼの阻害活性を測定す ることにより、 その物理化学的性状を利用し抽出精製することができる。
    [0293] IV型コラゲナ一ゼ活性は、 Saloらの方法 (J. Biol. Chem. , vol.258, 3058- 3063 (1983) ) の方法により測定することができる。
    [0294] すなわち、 IV型コラゲナ一ゼはヒトメラノーマ細胞の無 jd清培養液より調製し たものを、 また基質としては、 マウス EHS腫瘍より調製した IV型コラ一ゲンを放 射性同位元素で標識したものを用いてコラーゲンの切断を計測することにより測 定できる。
    [0295] IV型コラゲナーゼの阻害活性は、 この瞧反応液に検体を同時に添加し、 m 反応の阻害率を算定することにより、 測定することができる。
    [0296] ろ液または、 上清中に存在するマトリス夕チンは、 中性 PH条件下で水と混和し ない有機溶剤、 例えば n—ブタノール、 メチルェチルケトン、 酢酸ェチル、 クロ 口ホルム、 塩化エチレン、 塩化メチレンなどの単独または、 それらの組み合わせ により抽出精製することができる。 あるいは吸着剤として、 例えば活 ffi ^または 吸着用樹脂であるアンバーライ卜 AD — 2、 XAD - 4 (ローム 'アンド 'ハース 社製） 等や、 ダイヤイオン HP -10、 HP - 20、 CHP - 20P、 HP - 50 (三菱 ^βξ ㈱製） 等力 '使用される。 マトリスタチンを含む液を上記のごとき吸着剤の層を通 過させて不純物を吸着させて取り除く力 またはマトリスタチンを吸着させた後 、 メタノール水、 アセトン水、 η—ブタノール水などを用いて溶出させることに より得られる。 更にシリカゲル、 フロリジルのような坦体を用いた吸着カラムク 口マトグラフィー、 セフアデックス LH -20 (フアルマシア社製） などを用いた分 配カラムクロマトグラフィー、 セフアデックス G 25 (フアルマシア社製） など を用いたゲルろ過クロマトグラフィー、 および順相、 逆相カラムを用いた高速液 体クロマ卜グラフィ一等で本発明のマトリスタチンを精製することが出来る。
    [0297] [発明の効果]
    [0298] 試験例 1 . マ卜リス夕チンの IV型コラゲナーゼに対する阻害活性
    [0299] 実施例 2及び 3で得られたマトリスタチンについて、 IV型コラゲナーゼに対す る阻害活性を測定した。 結果 (150値で表わす） を以下に示す。
    [0300] マトリスタチン類 I5。 ( u g/ml)
    [0301] A , 0.23
    [0302] A 2 45
    [0303] B , 0.39 D 2.0
    [0304] E 10.3
    [0305] F 1.0
    [0306] [産業上の利用可能性]
    [0307] 本発明は、 マトリス夕チンを ¾成分とする、 血管新生抑制剤、 癌浸潤抑制剤 又は癌転移抑制剤に関するものである。
    [0308] 本発明のマトリス夕チンを、 血^ ί生抑制剤、 癌浸潤抑制剤又は癌転移抑制剤 として用いる場合、 種々の形態で投与される。 その投与形態としては例えば |£ 、 カプセル剤、 顆粒剤、 散剤、 シロップ剤等による経口投与または注射剤 （静脈 内、 筋肉内、 皮下） 、 点眼剤、 »J等による非経口投与を挙げることができる。 これらの各種製剤は、 常法にしたがって主薬に 1©¾剤、 結合剤、 崩壊剤、 潤沢剤 矯味矯臭剤、 溶解補助剤、 懸濁剤、 コ一ティング剤等 の医薬製剤 STi分野 において通常使用しうる既知の補助剤を用いて製剤化することができる。 その使 用量は症状、 年齢、 体重、 投与方法およ 形等によって異なる力通常は こ 対して 1日 50 mg乃至 1000 mgを投与することができる。
    [0309] 次に実施例、 試験例及び製剤例をあげて本発明を更に具体的に説明する。
    [0310] (実施例 1 ) SA K61488株の分離
    [0311] オーストラリァ国ダ一ビー市より纖した土壌 1 gを 9 ιη·6の菌水に懸濁し、 キサ一で充分攪拌し、 約 30分間放置した。 このようにして得られた土壌懸濁液 上清 1 m£を 1000倍希釈した後、 その上清 0.05 m を下記に示す分離用寒天培地 HA培地に滅菌コンラージ棒を用いて ¾し 28°Cにて 10日間培養した。
    [0312] H A培地
    [0313] 燐酸: ΙΤΚ素ナトリウム 0.2 g
    [0314] 塩化カリウム 0. 1 g
    [0315] 硫酸第一鉄 0. 1 g
    [0316] 硫酸マグネシウム 0. 1 g
    [0317] 炭酸カルシウム 5.0 g
    [0318] フミン酸 2. 0 g
    [0319] 20. 0 g イオン交換水 1000 m£
    [0320] pH (滅菌前） 7.4
    [0321] ァクチノマデュラ 'アトラメンタリァ SA &1488株は上記の HA¾天培 に出 現したコロニーからィ一スト麦魏天 (ISP2)の斜面培地に接種し、 28°Cで 14日間 培養して得られた。
    [0322] このようにして得られた本菌株はモノコロニー処理等により単一菌株であるこ とを確認した。 このようにして純粋培養された菌株は、 分散剤に 1 0 %スキムミ ルクを用いた 結!^アンプルとして保存した。
    [0323] (実施例 2 ) マトリスタチン 及び A2の精製
    [0324] (A) 培 養
    [0325] ァクチノマデュラ 'アトラメンタリア SANK61488株を、 無菌的に、 滅菌した後 述の誠の種培養培地 700 m£を含む 2 £の三角フラスコ （種フラスコ） に接種 した。 次いでこれを 28°Cで 8日間、 200 rpmのロータリー振とう機で前培養し た。 更に、 同培地 30 £を含む 60 タンクに、 この種培養液を 600 m£入れ、 28°C で 2日間培養した。
    [0326] 培地誠 騰難地）
    [0327] グルコース 10 g
    [0328] グリセロール 10 g
    [0329] ォ—卜ミール 5 g シユークロース 10 g
    [0330] S . B . M. 20 g
    [0331] カザミノ酸 5 g
    [0332] 生イースト 10 g
    [0333] イースト ·エキストラクト 3 g
    [0334] 炭酸カルシウム 1 g
    [0335] 消泡剤 （ニッサンディフォーム GB-442：
    [0336] 曰棚 0.2 g イオン交換水 1000 m£
    [0337] pH 7.0
    [0338] ^±咅養 の,の培地 （MP培地） を 600 タンクに 300 £入れ、 これを 120 °Cで 30分間加熱 菌した。 次いでこれに Jb の種培養液を 9 £入れ、 28°Cで 5日間 300 £Z分の空気 ¾ϋ*で攪拌 ^を 100 rpmにして攪拌培養した。
    [0339] 培觸脈 （MP培地）
    [0340] グルコース 5 g
    [0341] マル! ^一ス 15 g
    [0342] イースト *エキストラクト 3 g
    [0343] ファーマメディア 10 g
    [0344] 塩 ίヒナトリウム 3 g
    [0345] リン酸二カリウム 2 g 消泡剤 （ニッサンディフォーム CB-442) 0.2 g イオン交換水 1000 m-β
    [0346] pH 7.2
    [0347] (B) 単 離
    [0348] IV型コラゲナ一ゼの阻害活'性を測定することにより、 マトリス夕チン 及び A2を単離精製した。
    [0349] IV型コラゲナーゼ活性は、 Salo等の方法 (J. Biol. Chem. , vol.258, 3058-30 63， （1983) )を^して測定した。 すなわち、 IV型コラゲナ一ゼはヒトメラノ一 マ細胞の無 Jill清培養液より調製し、 また、 基質としてマウス EHS腫瘍より ΐνϋコ ラ一ゲンを調製し 3Η—無水酢酸で標識しすこ。
    [0350] この酵素液及び基質液を、 0.2Μ NaC£ , 10 ιπ CaCl2 ， 4 mM N—ェチルマレ イミド， 40 /z g / ιπ 7プロチニン， 0.05%Brij35を含む 50 mM 卜リス塩酸緩衝 液に添加し、 最終液量を 0.1 m .として 37°Cて 3時間^ ;させた。 トリクロル酢 酸 (TCA) を終濃度 2 %， タンニン酸を終濃度 0.1 %となるように加えて i芯を停 止させ、 4 °Cで 30分放置し、 4°C， 10, 000 rpni で 20分間遠心した。 この上清の —定量に Insta-gel (パッカード社製） 10 を加えて放射活性を測定した。 マトリスタチンの阻害活性は、 上 液に測定用のマ卜リスタチン溶液を添 加して、 同様の操作を行い、 放射活性を測定し、 ^¾反応の阻^より求めた。 培養ろ液 600 を 60 のダイヤイオン HP- 20 に付し、 200 のイオン交換水、 175 の 20%アセトンで洗浄後、 290 の 50%アセトンにて溶出し、 330 gの黒 色粉末を得た。 このうち、 150 g を 7.5 のイオン交換水に溶解し、 等量の n—ブ夕ノールを加え 30分間攪拌した。 4— 5時間静置すると 2層に分かれるの で、 上層 '下層を分離した。 下層にはさらに 6.5 £の n—ブタノ一ルを加えて再 び抽出した。 抽出液を合わせ、 濃縮 ·凍結 し 35.6 gの濃^ の粉末を得た。 この粉末を 200 m£の 80%メタノール一稀トリフルォロ酢酸（TFA) 水溶液 （pH 3. 5 ) に溶かし、 不溶物はろ過により除去した。 この溶液をセフアデックス L H 20 (カラムサイズ： 8.5 φ X 76cm) に ^した。 同じ溶媒で溶出し、 溶出開 始より 1.5 から 300 m£ずつ分画し、 20の画分を得た。 各画分の瞧 P且害活性 を測定し、 阻害活性の強い 5番目の画分を濃縮， し、 褐色粉末 2.52 g¾ 得た。 この粉末をさらに調製用の H PLCで精製した。 すなわち、 上記で得られ た褐色粉末のうち約 200 mgを 1.0 m£の 34%CH3C — 1 % (v/v) 卜リェチルァミ ンリン酸バッファ一 (pH 3.3) に溶解し、 同じ溶媒で 化した H PLCカラム
    [0351] (Seushupak ODS -5301N, 20φ X300 mm, センシュ一科^^) に し、 流 速 6.0 m /分で溶出した。 示 ¾ 折計でモニタ一し、 25分及び 32分に現われ るピークに相当する溶出液を分取した。 残りの褐色粉末についても同様の操作を 行い、 分取した溶出液をブールした。 それぞれの溶出液を E濃縮して、 ァセト 二卜リルを留去し、 この溶液をダイヤイオン HP— 20カラムに ^した。 カラム をよくイオン交換水で洗浄したのち、 50 m の 50%アセトンで溶出した。 溶出液 を濃縮， 凍結 することにより、 25分のピークに対応する溶出液からはマトリ スチン が 76 mg， 32分のピークに対応する溶出液からはマ卜リス夕チン A2の 112 mの白色粉末力 尋られた。
    [0352] (実施例 3) マトリスタチン の精製
    [0353] 実施例 2で記載した方法により IV コラゲナーゼ阻害活性を測定することによ り、 マトリス夕チン ^を精製した。
    [0354] 実施例 2 (A) で記載した方法により培養ろ液を調製した。 培養ろ液を 30 のダ ィャィォ: X HP— 20に付し、 100 のイオン交換水、 90 £の 20%アセトンで洗浄 後、 150 の 50%アセトンにて溶出し、 離^後 29.2 gの黒色粉末を得た。 こ れを 1.5 gのイオン交換水に溶解し、 等量の n—ブタノールで 2回抽出した。
    [0355] 2回分の抽出液をプールし濃縮'凍結^し、 5.29 gの濃 の粉末を得た。 こ の粉末を 40 m の 80%メタノール一稀 TFA水溶液 (PH 3.5) に溶かし、 同じ溶媒 平後 匕したセフアデックス LH (カラムサイズ： 60 X43 cm ) に" ^した。 同 じ溶媒で約 420 m£溶出すると黄色の溶出液が溶出し始める。 この時点より 500 m£を 取した。 このものを濃縮， |^して濃褐色の粉末 4.4 gを得た。 こ の粉末を 3回に分けて、 30%メ夕ノールで平衡化したローバー 'カラム
    [0356] (RP-8, サイズ B， メルク社製） に^し、 200 m の 30%メタノール、 そ れぞれ 300 m の 50%、 60%, 70%、 80%、 90%のメタノールで溶出した。 70%のメタノール画分に,阻害活性が見い出されたので、 このものを濃縮， 凍 結體し、 3回の操作で 1.10 gの褐色粉末を得た。
    [0357] この粉末を 3 し、 それぞれ 50%メタノールで 匕したセフアデックス C -25 (カラムサイズ 2.8 Φ X 70 cm ) に供与し、 約 1滴ノ 5秒の流速で溶出 し、 300滴 Z画分ずつ採取した。 54-57番目の画分を集め濃縮， し、 360 mの黄色粉末を得た。 このものを調製用 HPLCでさらに精製した。 すなわち、 1回の操作において約 50 mgの黄色粉末を 0.2 m£の 38%CH3CN - 0.2 %卜リエ チルァミンリン酸バッファー （PH 3.3) に溶解し、 同じ溶媒で^^化した。 Sens hu PAK0DS - 4251 Nカラム （10 φ Χ 250 mm) に^!して、 5.0 m ノ分で溶 出した。 示難折計でモニタ一し、 22分付近に現われるピークに相当する溶出液 を採取した。 残りの粉末についても同様の操作を行い、 ^¾した溶出液をプール した。 このものを E濃縮してァセトニ卜リルを留去し、 イオン交換水で 化 した。 約 10 m のダイヤイオン H P— 20に供与した。 カラムをイオン交換水でよ く洗浄したのち、 50 ra の 50%アセトンで溶出した。 溶出液を 下において濃 縮， 凍結 し、 75 mgの白色粉末のマトリス夕チン を得た。
    [0358] (実施例 4 ) マトリス夕チン D,， Ei , F, の精製
    [0359] (A) 培養
    [0360] ァクチノ？デユラ' アトラメン夕リア SANK 61488株を、 無菌的に滅菌した腿 の組成の種培養 i咅地 700 πι£を含む 2 1 の三角フラスコ （種フラスコ） に接種 した。 ついでこれを 28でで 8 日間、 200 rpmのロータリー振とう機で前培養 した。 更に、 同培地 30 を含む 60 タンクに、 この種培養液を 600 ιπ£入 れ、 28°C で 2日間培養した。
    [0361] 培職誠 養培地）
    [0362] グルコース 10 g
    [0363] グリセロール 10 g
    [0364] ォ一トミール 5 g
    [0365] シュ一クロース 10 g 大豆粉 20 g
    [0366] カザミノ酸 5
    [0367] 生イースト 10 g
    [0368] イースト ·エキストラクト · 3 g
    [0369] 炭酸カルシウム 1 g
    [0370] 消泡剤 （ニッサンディスフォ一一ム
    [0371] CB-422: 曰棚旨 （株） ) 0.2 g イオン交換水 1000 m£ pH 7.0 咅養は後述の の培地（MBG3-7改変培地） を 600£タンクに 300 £入れ、 こ れを 120 °Cで 30分間加熱 菌した。 ついでこれに の種培養液を 9£入れ、 28°C 5 日間 300 1/分の空気流量で攪拌速度を 100 rpnにして攪拌培養した。
    [0372] m . (MBG3-7 改変培地）
    [0373] グルコース 30 g
    [0374] グリセロール 70 g
    [0375] ポリ プトン 10 g
    [0376] ^MB IO g
    [0377] コーンスチープリカー 10 g
    [0378] 硫酸マグネシウム- 7水和塩 5 g
    [0379] 硝酸ナトリウム 5 g
    [0380] 消泡剤 （ニッサンディスフオーム
    [0381] CB-442) 0.2 g イオン交換水 1000 m£
    [0382] pH 7.2 ( B ) 単離
    [0383] 上述の培養で得た培養濾液を実施例 1とまったく同様にダイャィォン HP 20 n-BuOH 抽出、 及びセフアデックス LH 20 で処理した。 すなわち培養濾液を 60 のダイアイオン HP 20 に吸着し、 200 £のイオン交換水、 175 の 20% アセトンによる洗浄の後、 290 の 50¾ アセトンで溶出し、 濃縮、 を 行うことにより 540 g の黒色粉末を得た。 この粉末を 30 £の水に溶解し、 等 量の BuOHで 2回抽出した。 有機相を集め、 濃縮 することにより
    [0384] 158. 5gの濃^粉末を得た。 この粉末を約 18gずつ 80¾ メ夕ノール一卜リフル ォロ酢酸水溶液 PH 3. 5 に溶解し、 同じ溶媒で 化したセフアデックス LH 20 クロマト （カラムサイズ： 8. 5 φ X 76 cm) で精製し、 実施例 1で示した分画を 集めることにより褐色の凍結 ^品 73g を得た。 この粉末を 約 25 gずつ & 4¾メタノール- 2% (v/v) トリチェチルァミン、)ン酸緩衝液 H3. 0 に溶解し、 同じ溶媒で fi化した大量分取用液クロカラム （カラム： 栗田エ^， 0DS 15 一 30 ，10 X30 cm, 流速： 200 m£ /min、 検出： UV 230 ηπ ) にチャージ し、 同じ溶媒で溶出した。 溶出液の酵阻害活性を測定すると、 約 17分付近、 及び約 25分付近に活性ピーク力認められたので、 対応する溶出液を集め、 それ ぞれを溶出順に Υ 成分、 X成分とした。 Υ成分、 X成分の溶出液を濃縮してメ タノール 除き、 得られた水溶液を 100 m£ のダイアイオン HP 20 にチヤ一 ジし、 よく水洗した後に 80% メタノールで溶出した。 溶出液を濃縮、 凍結 し、 Y成分より 3.8g， X成分より 3. 2 gの粗粉末を得た。 以下、 X成分、 Y成 分の順に精製法について述べる。
    [0385] X成分
    [0386] X成分粗粉末 800 mgを 55¾メタノール- 2¾ (v/v) トリエチルァミンリン酸緩衝 液 PH3. 0 に溶解し、 同じ溶媒で ¥ ί化した分取用液クロカラム （カラム：
    [0387] Senshupak ODS-5301N, 20 ø x300 ran、 流速 6 ml/min 、 検出：示差屈折計） に チャージし、 同じ溶媒で溶出した。 溶出液の,阻害活性を測定すると、 約 27 分付近、 及び約 30分付近の示 折計で認められるピークに,阻害活性力認 められたので、 対応する溶出液を集め、 それぞれを溶出順に F 成分、 D成分と した。 D成分、 F成分の溶出液を濃縮してメタノールを除き、 得られた水溶液を 100 m のダイアイオン HP 20 にチャージし、 よく水洗した後に 80% メタ ノールで溶出した。 溶出液を濃縮、 し、 D成分より 24 ragの白色粉末を 単一成分として得た。 この物質をマトリスタチン とした。一方、 F成分より 24mの粉末を得たがこれは HPLG上で単一ではなかったので、 さらに以下のよう に精製した。 この粉末を 27¾ ァセ卜二トリル -2¾(v/v)卜リチェチルァミンリン 酸緩衝液 PH3.0 に溶解し、 同じ溶媒で 匕した分取用液クロカラム （カラム： Senshupak ODS-53OlN, 2O 0x3OO ran、 流速 6 ml/min、 検出：示差屈折計） に チャージし、 同じ溶媒で溶出した。溶出液の瞧阻害活性を測定すると、 約 31 分付近の示^ S折計で認められるピークに酵阻害活性が認められたので、 対応 する溶出液を集め、 濃縮してァセ卜二卜リルを^した。 得られた水溶液中の活 性物質を SEPPAK(C-18， E V タイプ、 millipore corp. Ltd. ) に吸着し、 80¾メ タノールで溶出した。溶出液を濃縮、 ^^ を行い、 単一成分の マ卜リス夕 チン を白色の粉末として 12 mg 得た。
    [0388] Y成分
    [0389] Y成分粗粉末 l を 20¾ァセ卜二トリル- 2¾ (v/v) 卜リチェチルァミンリン酸緩 衝液 PH3.0 に溶解し、 同じ溶媒で 化した分取用液クロカラム （カラム： Sens hupak ODS.-5301N, 20 φχ300 mm、 流速 6 ml/min、 検出：示差屈折計） にチヤ一 ジし、 同じ溶媒で溶出した。 溶出液の賺阻害活性を測定すると、 約 46分付近 の示^ S折計で認められるピークに^ S阻害活性が認められたので、 対応する溶 出液を集め、 濃縮してメタノールを除き、 得られた水溶液を 100 m£のダイアイ オン HP 20 にチャージし、 よく水洗した後に 80% メタノールで溶出した。 溶 出液を濃縮、 凍結乾燥し、 8 ragの粉末を得た。 この粉末を さらに 50% メタ ノール- 2¾ (v/v)卜リチェチルァミンリン酸緩衝液 pH3.0 に溶解し、 同じ溶媒で平 衡化した分取用液クロカラム （カラム： Senshupak ODS-5301N, 200x300 πη、 流 速 6 m£ /min. 検出：示 折計） にチャージし、 同じ溶媒で溶出した。 溶出液 の 阻害活性を測定すると、 約 30分付近の示 ^折計で認められるピークに 3 酵素阻害活性が認められたので、 対応する溶出液を集め、 濃縮してメタノールを 除去した。 得られた水溶液中の活性物質を SEPPAK (C-18， E V タイプ、 millipor e corp. Ltd. ) に吸着し、 80¾メタノールで溶出した。 溶出液を濃縮、 ^ ^ し、 6 mg マトリス夕チン を白色粉末として得た。
    [0390] (製剤例 1 ) 経口用カプセル剤
    [0391] 処 方
    [0392] マトリスタチン 30 mg
    [0393] 乳 糖 170 mg
    [0394] トウモロコシ澱粉 148.8 mg
    [0395] ステアリン酸マグネシウム 1.2 mg
    [0396] 350
    [0397] 上記処方の粉末を混合し、 30メッシュのふるいを通した後、 この粉末 350 mgを ゼラチンカプセルに入れ、 カプセル剤とした。
    [0398] 以上から、 本発明のマトリスタチン類は顕著な IV コラゲナ一ゼ阻^用を示 し、 例えば、 癌転 制剤として有用である。
    权利要求:
    Claims請求の範囲
    1 . —般式 ( で表わされる新規化^!マ卜リスタチン：
    (式中、 R1は水素原子又は水酸基、 R2は水素原子又はメチル基、
    R3は、
    式
    、 又は、
    を有する基を示す。
    但し、
    R1が水酸基、 R2がメチル基のときは、
    R3は、 式 （n) 、 (m) 、 (IV) 又は （V) であり、
    R1が水素原子、 R2がメチル基のときは、
    R3は、 式 （Π) であり、
    R1が水酸基、 R2が水素原子のときは、
    R3は、 式 (IV) である。 ）
    2. ァクチノマデュラ属に属するマ卜リス夕チン^菌。
    3. 請求項 2記載のァクチノマデュラ属に属するマ卜リスタチン^菌が、 ァク チノマデュラ ·ァ卜ラメンタリア SANK 61488株 （»：研条寄第 3327号： BP - 3327 ) である菌。
    4. ァクチノマデュラ属に属するマトリスタチン^菌を培養し、 その培養物よ りマ卜リスタチンを することを特徴とするマ卜リスタチンの 法。
    5. 請求項 4記載のァクチノマデュラ属に属するマトリスタチン^菌が、 ァク チノマデュラ ·アトラメンタリア SANK61488株 （ 江研条寄第 3327号： BP-3327 ) であるマトリスタチンの製造法。
    6. 請求項 1記載のマトリスタチンを ¾J成分とする、 血^ ί生抑制剤。
    7. 請求項 1記載のマトリスタチンを ¾成分とする、 癌浸潤抑制剤。
    8. 請求項 1記載のマ卜リス夕チンを雄成分とする、 癌転棚制剤。
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1991-11-28| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): CA HU KR SU US |
    1991-11-28| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE DK ES FR GB GR IT LU NL SE |
    1994-01-21| NENP| Non-entry into the national phase|Ref country code: CA |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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